クロロフィル蛍光測定法：PAM蛍光光度法

クロロフィル蛍光測定法について

クロロフィル蛍光の測定プロトコルは、過去1世紀にわたり生物物理学者たちによる科学的研究を通じて発展してきました。そして過去20年間で、この基礎研究はフィールドでの実用アプリケーションへと導入されるようになりました。光合成プロセスのさまざまな側面を分析するために多様なアプローチが開発されており、これらは大きく次の3つのタイプに分類できます。「シングルターンオーバーフラッシュ（単一代謝回転フラッシュ）」、「クロロフィル蛍光の高速誘導（インダクション）」、 tender 「光合成定常状態の消光（クエンチング）分析」です。

これらのタイプは組み合わせることも可能ですが、最も一般的には2つの代表的な技術プラットフォームを通じて実装されています。それが、PAM（Pulse-Amplitude Modulation：パルス振幅変調法）と、連続励起による蛍光の高速多相的上昇（OJIPと呼ばれる）です。

2009年から2019年までに、クロロフィル蛍光技術を用いた科学論文は合計4,490報発表されました（Zavafer et al. 2020）。それらの論文のうち、PAMは2,459報（全出版物の55%）で使用され、OJIPは1,073報（24%）を占めていました。

本ブログでは、最も広く採用されている手法である「PAM蛍光光度法」について詳しく掘り下げていきます。

PAM蛍光光度法（PAM Fluorometry）

PAM蛍光光度法プロトコルは、変調光（モジュレーション光）を用いて蛍光を測定します。この測定光は、異なる周波数で照射できる極めて短いパルス（マイクロ秒単位）で構成されています。この測定パルス自体は非常に短いため、光合成に影響を与えることはありません。これにより、さまざまな光化学的シナリオにおいて、蛍光収量が植物の光合成活性を高い信頼性で反映できるようになります。

図1は、PAM蛍光光度法プロトコルの全体像を示しており、「暗適応測定」、「明適応測定」、および「暗回復（リカバリー）測定」の各セクションに分かれています。以下でそれぞれのセクションについて詳しく解説します。

PAM – 暗適応測定（Dark Adapted Measurement）

科学分野で非常によく使われるクロロフィル蛍光分析のパラメータの一つに、光化学系IIの最大潜在効率（Fv/Fm）があります。光化学系II（PSII）は光合成の主要な構成要素であり、水の分解と励起された電子の伝達を担っています。したがって、Fv/Fmは植物の光合成潜在能力の指標として機能し、すべての光化学系が「開いた」状態にあるときに植物が光を完全に利用する能力を反映します。すべての光化学系が開いていることを確実にするため、植物は15〜30分間、またはそれ以上の間、完全に暗い状態に保たれる必要があります（暗適応）。この期間によって、それまでの消光（クエンチング）が解除され、正確な測定が可能になります。

暗適応の後、極めて短い測定光パルスを用いて基準蛍光レベル（Fo）が測定されます（図2）。Foは、すべての反応中心が「開いて」いるときにPSIIから放出される最小の蛍光レベルを反映しています。この光パルスは非常に短いため、蛍光放出とごくわずかな光合成以外に、反応中心内でのエネルギー移動は起こりません。

次に、光化学系を完全に飽和させるために、飽和光パルス（>6000 μmol m⁻² s⁻¹：太陽光の強度の約3倍）が照射されます。光合成プロセスはこの極端な光に適応しなければなりませんが、それには少し時間がかかります。系内が電子で溢れかえり、電子伝達鎖が実質的に目詰まりを起こすことで、一時的に光合成がブロックされます。この間、エネルギーは光合成へと流れることができないため、蛍光収量は最大値である「Fm」へと上昇します（エネルギーの3つの運命を思い出してください）（図3）。この測定は、他のエネルギー移動プロセス（熱放散：NPQ）がゼロでなければならないため、暗適応した植物で行われます。

FoとFmの差は可変蛍光（変動蛍光）「Fv」として知られており、Fmに対する比率（式1）として計算され、PSIIの最大潜在効率が算出されます。測定中に他の競合するプロセスが活性化していないため、この値は最大潜在効率を表します。

PAM – 明適応測定（Light Adaptation Measurement）

植物の光への適応を測定するために、規定の強度で化学光（アクチニック光）が点灯されます。化学光は光合成を誘導します。化学光の照射期間中、植物内で起こっている消光（クエンチング）プロセスを評価するために、測定光パルスと飽和光パルスを用いた複数の測定が行われます。

光が当たっている状態で測定される最小蛍光と最大蛍光の値は、暗状態とは異なる名前で呼ばれます。それぞれ「Fs’」および「Fm’」です（図2）。Fs’とFm’の差は「Fq’」と呼ばれます。

グラフのラインの挙動は、植物の光適応プロセスを反映しています。光条件下では、植物はすべての光エネルギーを光合成に使用できるわけではないため、余剰エネルギーを安全に熱として放散するプロセスも開始します。これを「非光化学的消光（NPQ：Non-Photochemical Quenching）」と呼びます。植物が光に適応するにつれてNPQは増加するため、ラインは傾斜します。最終的に、蛍光収量は定常状態に達します。

Fq’とFm’の値から、実際の光合成効率（ΦPSIIと呼ばれる）を計算することができます（式2）。

ΦPSIIを使用することで、電子伝達速度（ETR：Electron Transport Rate）を計算できます（式3）。ETRは植物科学で広く使用されているパラメータであり、ΦPSIIに対する主な利点は、光強度と光吸収率が考慮されているため、特定の環境における実際の光合成活性をより正確に表すことができる点です。これは実際の二酸化炭素固定量と高い相関性があります。

一方、ΦPSII単体でも、光強度が一定である制御された条件下や、処理間での相対的な効率を比較する場合には、光強度や光吸収率の測定を必要としないシンプルな評価方法として有用です。

ここで、アルファ（α）は葉の吸光度、PSII比率（β）はPSIIによって吸収される光の割合、化学光強度（I / PAR）は化学光の光合成有効光量子束密度（PPFD、μmol m⁻² s⁻¹）です。

NPQは、光の中での最大蛍光（Fm’）と、暗適応下での最大蛍光（Fm）を比較することによって計算されます（式4）。

暗回復（Dark Recovery）

光を照射した後の暗状態において、植物は吸収した光エネルギーによる消光状態から徐々に回復（アン・クエンチング）します。この回復プロセスをモニタリングすることで、高速で緩和する成分と低速で緩和する成分として特徴付けられる、異なる消光メカニズムについての知見を得ることができます。

暗回復は、暗適応ステージと明適応ステージを連続して行う消光プロトコルを用いて測定できます。化学光がオフになった直後に、低強度の遠赤色光パルス（約5秒感）が照射されます。このパルスは、電子伝達鎖から電子を「洗い流す（フラッシュする）」役割を果たします。遠赤色光が使用される理由は、光化学系I（PSI）のみがそれを吸収し、伝達鎖内の電子キャリアからすべての電子を効率的に吸収するためです。

この処理の後に測定される最小蛍光は、「Fo’」と呼ばれます。

Fm’とFo’の差は「Fv’」と呼ばれます。遠赤色光パルスの後に測定される最大蛍光は、「Fm”」（プライムが1つではなく2つ）と呼ばれます。

これらの値を収集した後、さらに詳細な光化学的および非光化学的パラメータを計算することができます。

さらなる光化学的消光パラメータ

ほかに頻繁に使用される計算される光化学的パラメータとして、「qP」と「qL」があります。

qPは、光化学反応を行うことができる「開いた」状態にあるPSII反応中心の割合の推定値を表し、次の公式（式5）を用いて導き出されます。

球体ですが、研究により、qPと開いたPSII反応中心の割合との相関関係は必ずしも線形ではないことが分かっています。この非線形性は、qPが「パドルモデル（水たまりモデル）」に基づいているためです。パドルモデルでは、各PSII反応中心が独自のアンテナシステムを持って独立して機能し、異なる複合体間でのエネルギー移動はないと仮定されています（Kramer et al., 2004; Baker, 2008）。しかし、このモデルが必ずしも生理学的な現実を反映していないことを示す証拠が提示されています（Butler, 1978; Lavergne & Trissl, 1995; Lazer, 1999; Barber, 2003; Kramer et al., 2004）。

Barber（2003）は、PSII反応中心がチルコイド膜内で二量体（ダイマー）を形成していることを示し、その後の研究で、それらがユニット間での励起エネルギー移動が可能な共有アンテナマトリックスに埋め込まれていることが判明しました（Baker, 2008）。この構成は「レイクモデル（湖モデル）」または「結合ユニットモデル」として知られており、大半の酸素発生型光合成生物、特に高等植物をより正確に表していると考えられています。

レイクモデルに基づき、Kramerら（2004）は、開いたPSII反応中心の割合をより正確に推定する新しいパラメータ「qL」（式6）を導き出しました。

qLは広く認められており、理論的に洗練された測定法を提供しますが、実際の応用や解釈においては複雑さやいくつかの制限も伴います。理論的な優位性があるにもかかわらず、研究では依然としてqPが頻繁に使用されています。研究者はコントロール（対照群）と比較した相対的な変化や傾向を重視することが多く、一貫した測定が行われれば、qPは依然として処理間のストレスを示す優れた指標となり得ます。

さらなる非光化学的消光パラメータ

暗回復（消光解除）の間、異なる非光化学的消光メカニズムはそれぞれ異なる速度で回復します。これらの変動により、高速で緩和する成分と低速で緩和する成分を区別することができます。前述のNPQ値（式4）は高速な消光メカニズムであり、暗黒化すると速やかに緩和します。

しかし、高速と低速の両方の消光プロセス（状態遷移や光阻害など）を含むパラメータが必要な場合は、係数「qN」（式7）を使用できます。このパラメータは、qN = qE + qT + qI であるため、これらのプロセスを効果的に分化させます。

qE（エネルギー消光）（式8）は、2〜5分以内に起こる高速緩和プロセスです。対照的に、qI（光阻害消光）（式9）は、光阻害の程度に応じて数時間から数日間に及ぶ可能性のある低速緩和プロセスです。この長期にわたる回復時間は、植物が修復しなければならないPSIIユニットの損傷レベルに依存します。

なお、qNの制限として、値が高くなったときに変化に対する感受性が低下し、応答性が悪くなるという点が挙げられます。

全エネルギー分配（Total Energy Partitioning）

制御されたエネルギー放出に加えて、一部のエネルギーは制御されていない（非調節的な）方法で放出されます。光化学的消光（PQ）や非光化学的消光（NPQ）といった他のエネルギー放出形態との相対関係から、この形態のエネルギー放出を導き出して量子収率を得ることができます。ここでも開いたPSII反応中心の割合（qL）が使用されます。この非調節的エネルギー放出の量子収率は「ΦNO」と表現され、次の公式（式10）を用いて計算できます。

非調節的エネルギー放出の量子収率が確立されると、NPQの量子収率（ΦNPQ）を計算することができます（式11）。

これらの計算により、吸収されたエネルギーを「光化学反応」、「調節された熱放散」、「非調節的な損失」に分配することができ、植物のエネルギー分配に関する貴重な知見が得られます。なぜなら、以下の関係が成り立つからです：
ΦPSII + ΦNPQ + ΦNO = 1

暗適応なしでのNPQの導出

NPQは、光合成の研究や植物の効率最適化において重要なパラメータです。しかし、NPQを測定するには、暗状態での最大蛍光収量（Fm）を決定する必要があります。植物の暗適応は実用的に常に可能であるとは限らず、適応時間が短すぎるとエラーを引き起こす可能性があります。これに対処するため、Tietzら（2017）は、Fmの代わりにパラメータ「Fo’」を基準として使用してNPQを推定する方法を提案しました。このアプローチにより、NPQ(t)という新しい方程式が導かれました。

NPQとNPQ(t)の値は、ほとんどの場合において高い線形性と正確性を示します。ただし、この公式はいくつかの仮定に基づいており、それが制限となる場合があります。これらの仮定については彼らの論文で議論されており、ディスカッションのセクションで潜在的なデメリットの概要が提供されています。