コラム
ColumnPhenoVation社 クロロフィル蛍光測定法：OJIPプロトコル
クロロフィル蛍光測定法：OJIPプロトコル
クロロフィル蛍光は、植物の光合成効率を非破壊かつ迅速に測定できる最もポピュラーな技術のひとつです。植物の生理状態や、周囲の環境にどのように反応しているかを深く理解するために活用されています。この技術は、新しい品種を育成する際の迅速なスクリーニングや、新製品（肥料や薬剤など）の効果をテストする上で非常に有用です。また、ハイテク温室（グリーンハウス）においては、植物からのダイレクトなフィードバックが、環境制御や照明のマネジメントを行う上で極めて重要であることが証明されています。さらに、生態学、林業、普通作物農業などの分野でも、ドローンや人工衛星（太陽光誘導クロロフィル蛍光：SIFを利用）を用いたクロロフィル蛍光技術の導入がますます進んでいます。
PhenoVation社の「CF2GO」や「PlantExplorer」システムは、PAMまたはOJIPプロトコルを介してクロロフィル蛍光を測定します。PAMプロトコルでは、測定中に最小蛍光と最大蛍光という2つの異なる状態を測定します。これを行うために、植物に変調された測定光パルスを照射して蛍光シグナルを取得します（詳細については、PAMプロトコルに関する詳細なブログを参照してください）。最小蛍光と最大蛍光の差は、植物が光エネルギーを化学エネルギーにどれだけ効率的に変換しているかの指標となります。
一方、OJIPプロトコルも最小蛍光と最大蛍光を測定しますが、特に最大値に至るまでの「蛍光の上昇（ライズ）プロセス」に細かく焦点を当てます。文献などでは、これは「カウツキー効果（Kautsky効果）クロロフィル蛍光誘導ダイナミクス」と呼ばれています。この蛍光の上昇は一見シンプルに見えるかもしれませんが、植物がどのように機能し、エネルギーを処理しているかに関する驚くほど多くの情報を含んでおり、過去1世紀にわたり基礎科学者によって徹底的に研究されてきました。
カウツキー効果を説明するモデルの中で、特に大きな影響を与えたのがストラッサーら（Strasserら、1995）によって開発されたモデルであり、これがOJIPプロトコルの基礎を形成しています。OJIPプロトコルはCF2GOシステムにも配備されており、以前のブログでも簡単に触れました。しかし、OJIPからは非常に多くの重要かつ高感度なパラメータが導き出されるため、その複雑さを考慮し、今回はひとつの記事を丸ごと費やして解説することにしました。本稿では、まずストラッサーによるこの理論モデルを深く掘り下げます。続く第2部において、導き出される各測定パラメータについて詳しく解説していきます。
ストラッサーのモデルに基づくOJIPの上昇プロセス
OJIP測定では、極めて強い光（強光フラッシュ）を植物に対して1秒間照射します。蛍光は非常に微弱なシグナルであるため、高度な高感度センサーとフィルターを備えた専用カメラが、植物から放出される蛍光の上昇プロセスを正確にキャプチャします。
この蛍光の上昇は、直線的（リニア）に進むわけではありません。時間を対数軸（ロガリズミック・タイムスケール）でプロットすると、以下のような特徴的なパターンが浮かび上がります。
グラフに見られるように、蛍光レベルは3つのステップを経て上昇します（ストラッサーはこれを「三相的ダイナミクス（triphasic kinetics）」と呼びました）。これらのステップは、それぞれJプラトー、Iプラトー、Pプラトーと呼ばれます。最初の段階である「J」プラトーは3ミリ秒以内に現れ、続いて「I」プラトーが約33ミリ秒付近に現れます。最終的に、「P」プラトーはピーク、すなわち最大蛍光をマークし、通常は300〜800ミリ秒の間に達します。
これらのステップは理由なく現れるわけではありません。光合成機構における最初の電荷分離（ドナーからアクセプターへの電子伝達）とそれに続く反応のプロセスを追跡しているからこそ、このような形状になります。以下に、ストラッサーのモデルに従って各ステップのメカニズムを解説します。
O-J ステップのメカニズム
光エネルギーが光化学系のアンテナ色素に吸収された瞬間、ほぼ瞬時に（フェムト秒単位で）、反応中心の周囲にあるクロロフィルがこの電荷によって「励起（エキサイト）」されます。水の分解によってシステム内に導入された電子が、このエネルギーを運ぶ役割を担います。
電荷を帯びた電子が電子伝達鎖の中を移動するためには、光化学系II（PSII）における最初の電子受容体である**$Q_A$**が「開いた」状態（電子が結合していない空席の状態）でなければなりません。$Q_A$が励起された電子を受け取った瞬間、励起エネルギーのごく一部が蛍光として放出されます。これが、私たちが検出する最小蛍光、あるいは原点（Origin）蛍光、すなわち**$F_o$**です。このプロセスは非常に素早く起こり、$F_o$はわずか0.05ミリ秒の時点で測定されます。
QAが電子によって「占有（閉鎖）」されると、その電子が次の電子キャリアであるQBに渡されるまで、新しい電子を受け取ることができなくなります。しかし、クロロフィルが光によって励起される速度は、電子が次へと流れる移動速度よりも高速です。そのため、QAが占有されている間は、吸収された光エネルギーは電子伝達鎖の先へと進むことができません。行き場を失った励起クロロフィルは、過剰なエネルギーを蛍光として放出することで、基底状態（電荷のない状態）へと戻ろうとします（エネルギーの3つの運命のひとつです）。この結果として蛍光レベルが上昇し、これが蛍光誘導曲線におけるOからJへの立ち上がりとして観察されます。
J-I ステップのメカニズム
電子がQAからQB（PSIIにおける2番目の電子キャリア）へと伝達されると、QAは再び次の電子を受け取ることができるようになります（再開放）。これにより、光エネルギーは再び光化学反応（光合成）に利用できるようになるため、蛍光として放出されるエネルギーの割合は減少します（吸収された光の3つの運命を思い出してください）。したがって、QAからQBへの電子の移動は、蛍光レベルの「一時的な安定化」をもたらします。なぜなら、QAが閉じる速度と、 QAが再び開く速度が一時的に釣り合うからです。この安定化はおよそ3ミリ秒の時点で可視化され、蛍光が一定の定常レベルに達します。これがJプラトーです。
2番目の電子キャリアであるQBは、次の電子受容体に電子を渡す前に、2つの電子を受け取る必要があります。QBはQAから2つ目の電子を受け取ると、ストロマから2つのプロトン（H+）を取り込み、プラストキノール（PQH2）へと変化します。その後、$PQH_2$は光化学系IIを離れ、チラコイド膜内のプラストキノン（PQ）プールへと拡散していきます。
最終的に、シトクロムb6f複合体がこれらの電子を受け取ります。しかし、シトクロムb6fがPQH2から電子を受け取って処理する速度には物理的な限界（有限の速度）があり、これが電子伝達のボトルネック（渋滞）を引き起こします。
シトクロムb6fの処理能力に制限があるため、電子を抱えたPQH2がプール内に蓄積し、電子の流れが停滞し始めます。QBが電子で占有されたままになるため、QAも新しい電子を先へと送ることができなくなります。結果として、光エネルギーが電子伝達鎖に入れなくなり、再び励起されたクロロフィルが基底状態に落ちる際にエネルギーを蛍光として放出します。これが、JからIへの2度目の蛍光上昇を引き起こす原因です。
I-P ステップのメカニズム
電子伝達鎖のさらに下流では、流れてきた電子がプラスocyanin（PC）や光化学系I（PSI）によって受け取られ始めます。光化学系Iはこれらの電子を、新しく吸収した光エネルギーとともに利用して、光合成の明反応の主要製品であるNADPHの生成を駆動します。
この下流への電子の流れが継続している間は、新しい電子が光化学系IIから電子伝達鎖へとスムーズに入ることができます。これは、光エネルギーが蛍光として放出される代わりに、再び光化学反応（光合成）のために消費されていることを意味し、蛍光レベルに新たな安定化をもたらします。これがIプラトーです。
しかし、これまでのステージと同様に、PCや光化学系I（PSI）がフル効率に達するまでにはわずかな時間差（遅延）が生じます。この遅延が、伝達鎖のさらに下流に新たなボトルネックを生み出します。1秒間の光パルス中に照射される極限の強光条件下においては、最終的にシステム全体が完全に飽和し、すべての電子キャリアが「閉鎖」され、これ以上電子を受け取ることができない状態に陥ります。
この状態に達すると、光エネルギーは完全に電子伝達鎖に伝達できなくなり、励起されたクロロフィルはみたび基底状態へと戻る際に、余剰エネルギーのすべてを蛍光として一斉に放出します。これが蛍光の最終的な上昇を導き、OJIP曲線におけるPピーク、すなわち最大蛍光レベル（Fm）へと達します。
OJIPデータから何が分かるのか？（実用的なアプローチ）
解説した通り、わずか1秒間の光パルスを照射する間に、植物の内部で起こっている極めて多くの微細な生理プロセスを連続的に追跡することができます。これらの各プラトーの位置や、描かれる曲線の形状（形状の変化）を解析することで、光合成システムの機能や効率を正確に数値化（定量化）することが可能になります。
ストラッサーとその共同研究者たち、およびその他の研究グループは、植物の光合成機構がどのように機能しているかを計算するための25以上の算出公式（JIPテストと呼ばれるアルゴリズム）を構築しました。これらの誘導パラメータは、システム全体の包括的な効率を示すものから、以下のような個別のプロセスをピンポイントにズームインして評価するものまで多岐にわたります。
- 光吸収および捕獲（トラッピング）に関するパラメータ： アンテナサイズ、反応中心あたりの捕獲エネルギーフラックス、最初の電子受容体（$Q_A$）の効率など。
- 反応中心に関するパラメータ： クロロフィルあたりの反応中心数、開いている反応中心の数、各反応中心単位での処理効率など。
植物が水不足（乾燥）、高温・低温ストレス、塩害、あるいは病害虫や病気による被害を受けると、これらのシステム機能に多大な悪影響が及びます。したがって、OJIP測定を行うことで、これらのパラメータの変化から「どのプロセスがストレスによって阻害されているのか」を的確に検出することができます。また、各種資材や製品（光合成促進剤や保護剤など）が植物に及ぼす作用機序（モード・オブ・アクション）を定量的に評価・証明するのにも非常に有効です。
次回のOJIPブログ第2部では、このOJIPの上昇から計算される具体的なパラメータの意味を深く解説するとともに、各種ストレスがそれらにどのような影響を与えるのかを詳しくまとめてご紹介します。
参考文献（References）
- Strasser, R.J., Srivastava, A. and Govindjee (1995). Polyphasic chlorophyll a fluorescence transient in plants and cyanobacteria. Photochemistry and Photobiology 61: 32-42.
- Strasser, R.J., Srivastava, A. and Tsimilli-Michael, M. (2000). The fluorescence transient as a tool to characterize and screen photosynthetic samples. In: Yunus, M. (Ed.) Probing Photosynthesis: Mechanisms, Regulation and Adaptation. Taylor and Francis, London: 445-483.
- Strasser, R.J., Tsimilli-Michael, M. and Srivastava, A. (2004). Analysis of the Chlorophyll a fluorescence transient. In: Papageorgiou, G.C. and Govindjee (Eds.) Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis. Springer, Dordrecht: 321-362.
- Tsimilli-Michael, M. (2020). Revisiting JIP-test: An educative review on concepts, assumptions, approximations, definitions and terminology. Photosynthetica 58: 275-292.
